研究背景與成果

生物分子的結(jié)構(gòu)解析與相關(guān)生物學(xué)功能的關(guān)聯(lián)研究已成為現(xiàn)今生命科學(xué)的前沿。生物分子存在多級(jí)結(jié)構(gòu)，而其結(jié)構(gòu)復(fù)雜度的一個(gè)重要因素為分子異構(gòu)。不同的異構(gòu)分子（Isomers and isoforms）具有相同的化學(xué)式和分子量，但化學(xué)結(jié)構(gòu)不同。例如，單糖存在多種異構(gòu)體，包括葡萄糖、果糖、半乳糖等；多糖由單糖兩兩通過(guò)糖苷鍵相互連接組成，導(dǎo)致出現(xiàn)更為復(fù)雜的構(gòu)造異構(gòu)（分子中原子或原子團(tuán)互相連接次序不同，Structural or constitutional isomers）和立體異構(gòu)現(xiàn)象（連 接 次 序 相 同 但 空 間 排 列 不 同，Spatial isomers or stereoisomers）。

離子遷移（Ion mobility, IM）與質(zhì)譜（Mass spectrometry, MS）聯(lián)用（IM-MS）分析已經(jīng)發(fā)展為生物分子特別是生物大分子結(jié)構(gòu)解析的一種主要手段，并成為質(zhì)譜儀器發(fā)展的主要方向。IM可以區(qū)分MS不能區(qū)分的異構(gòu)體或同重素（Isobars），這一獨(dú)到的特性對(duì)生物分子的結(jié)構(gòu)解析研究十分關(guān)鍵，近年來(lái)被廣泛用于糖結(jié)構(gòu)、脂質(zhì)結(jié)構(gòu)、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和活性、蛋白質(zhì)-分子相互作用等研究中。近年來(lái)，多種IM 分析方法被紛紛提出，例如遷移時(shí)間 DTIMS （Drift time ion mobility spectrometry）、囚禁式 TIMS（Trapped ion mobility spectrometry）、行波 TWIMS（Travelling wave ion mobility spectrometry） 以及非對(duì)稱場(chǎng) FAIMS（Field asymmetric ion mobility spectrometry）等。然而，這些技術(shù)均基于低E/N場(chǎng)原理（E/N < 30 Td，E代表電場(chǎng)場(chǎng)強(qiáng)，N代表中性氣體數(shù)密度，Td是Townsend數(shù)），分離分辨率一般在40-200，不足以解決目前生物分子異構(gòu)體解析研究的迫切需求。

圖1. 離子云掃描分析技術(shù)的儀器設(shè)置、原理和性能表征。（a）Mini β質(zhì)譜儀器系統(tǒng)。（b）實(shí)驗(yàn)裝置示意圖。（c）離子云掃描技術(shù)原理。強(qiáng)迫振動(dòng)下的兩種異構(gòu)體離子（紫色和藍(lán)色）的離子軌跡。（d）獲得的離子云掃描譜圖。

針對(duì)以上難題，清華大學(xué)精密儀器系生物醫(yī)學(xué)儀器與應(yīng)用研究團(tuán)隊(duì)向高E/N場(chǎng)尋求突破離子遷移分析低分辨率的局限，提出一種超高場(chǎng)離子云掃描技術(shù)，并在Mini β質(zhì)譜儀器系統(tǒng)（PURSPEC科技(北京)有限公司）上實(shí)現(xiàn)遷移分辨率超過(guò)10,000的高分辨IM分析，提升較現(xiàn)有技術(shù)水平一個(gè)數(shù)量級(jí)以上（圖1）。超高場(chǎng)離子云掃描技術(shù)采用強(qiáng)迫振蕩的物理原理，在超高場(chǎng)（約1×105 Td）條件下實(shí)現(xiàn)異構(gòu)體離子的離子云分離，通過(guò)掃描激發(fā)振蕩電壓可以獲得異構(gòu)體離子的高分辨IM譜圖。

成果優(yōu)勢(shì)

利用高場(chǎng)離子云掃描分析技術(shù)，對(duì)四種二糖異構(gòu)體 （海藻糖、麥芽糖、纖維二糖和乳糖，圖2a）開(kāi)展了結(jié)構(gòu)分析（圖2b），并對(duì)乳糖和纖維二糖的混合物進(jìn)行了離子云掃描分析（圖2c），并與傳統(tǒng)串聯(lián)質(zhì)譜分析（圖2d）結(jié)果對(duì)比。從圖2d可見(jiàn)，乳糖和纖維二糖具有到相同的碎裂模式，無(wú)法通過(guò)串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)加以區(qū)分。但這兩種異構(gòu)體可以通過(guò)離子云掃描實(shí)現(xiàn)完全分離（圖2c）。此外，離子云掃描分析技術(shù)也展現(xiàn)出優(yōu)異的定量分析特性（圖2e和2f）。

圖2. 二糖異構(gòu)體分析。（a）四種二糖異構(gòu)體及其（b）離子云掃描譜圖。乳糖和纖維二糖混合物的（c）離子云掃描譜圖和（d）串級(jí)質(zhì)譜分析譜圖。（e）兩種二糖標(biāo)準(zhǔn)品及（f）混合物的定量分析結(jié)果。

離子云掃描技術(shù)對(duì)各類生物分子異構(gòu)體具有普遍適用性。如圖3所示，該技術(shù)同樣可分辨脂質(zhì)和多肽分子異構(gòu)體。研究工作中，離子云掃描方法展現(xiàn)出多種優(yōu)點(diǎn)，如分析部件結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、操作方便、具有強(qiáng)大的時(shí)間/空間串級(jí)質(zhì)譜能力等，可以方便地與多類質(zhì)量分析器聯(lián)用，用于設(shè)計(jì)混合型串聯(lián)分析質(zhì)譜儀器，在生物分子復(fù)雜結(jié)構(gòu)解析上展現(xiàn)出較好的應(yīng)用前景。

圖3. 脂質(zhì)與多肽異構(gòu)體分析。（a）脂質(zhì)異構(gòu)方式示意圖。各種脂質(zhì)異構(gòu)體的離子云掃描譜圖：（b）sn異構(gòu)、（c）碳碳雙鍵位置異構(gòu)和（d）雙鍵順?lè)串悩?gòu)。（e）多肽的不同翻譯后修飾類型及其異構(gòu)方式示意圖。不同翻譯后修飾類型的多肽異構(gòu)體離子云掃描譜圖：（f）甲基化、（g）乙酰化和（h）磷酸化。

本研究由國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目和清華大學(xué)精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)科研項(xiàng)目資助。論文第一作者為清華大學(xué)精儀系周曉煜副教授，通訊作者為歐陽(yáng)證教授，其他作者還包括精儀系博士生王卓凡和范菁津，第一完成單位為清華大學(xué)精密儀器系精密測(cè)試技術(shù)與儀器國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室。這項(xiàng)研究也得到了清華大學(xué)化學(xué)系瑕瑜教授、精儀系馬瀟瀟副教授與張文鵬助理教授的大力幫助。

論文鏈接：

https://www.nature.com/articles/s41467-023-37281-7